Expression Clone
| Basic Informations | Advanced Informations |
| Kind | E.coli N-GST |
a)
b)
a) CBB staining
b) Western blot
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| Clone ID | KE0005_eNGST | |
| 예상 사이즈 (kD) | 47.9 | |
| 실제 사이즈 (kD) | 48.1 | |
| Vector | pDEST15 | |
| Tag | N-GST | |
| Price | \110,000 (부가세 포함가) | |
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이미지가 없습니다 | |
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| Kind | Mammalian C-EGFP |
이미지가 없습니다
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| Clone ID | KE0005_mCEGFP | |
| 예상 사이즈 (kD) | 47 | |
| 실제 사이즈 (kD) | X | |
| Vector | pDEST47 | |
| Tag | C-EGFP | |
| Price | \110,000 (부가세 포함가) | |
| 형광사진 (클릭하여 크게보기) |
 "200X_1")  "200X_2")
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| Kind | Mammalian N-EGFP |
a)
b)
a) CBB staining
b) Western blot
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| Clone ID | KE0005_mNEGFP | |
| 예상 사이즈 (kD) | 47 | |
| 실제 사이즈 (kD) | 52.9 | |
| Vector | pDEST53 | |
| Tag | N-EGFP | |
| Price | \110,000 (부가세 포함가) | |
| 형광사진 (클릭하여 크게보기) |
 "100X_1")  "100X_2")  "200X_1")  "200X_2")
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| Clone information |
Protein sequence length | 184 |
| DNA sequence | ATGGTTCGCTATTCACTTGACCCGGAGAACCCCACGAAATCATGC AAATCAAGAGGTTCCAATCTTCGTGTTCACTTTAAGAACACTCGT GAAACTGCTCAGGCCATCAAGGGTATGCATATACGAAAAGCCACG AAGTATCTGAAAGATGTCACTTTACAGAAACAGTGTGTACCATTC CGACGTTACAATGGTGGAGTTGGCAGGTGTGCGCAGGCCAAGCAA TGGGGCTGGACACAAGGTCGGTGGCCCAAAAAGAGTGCTGAATTT TTGCTGCACATGCTTAAAAACGCAGAGAGTAATGCTGAACTTAAG GGTTTAGATGTAGATTCTCTGGTAATTGAGCATATCCAAGTGAAC AAAGCACCTAAGATGCGCCGCCGGACCTACAGAGCTCATGGTCGG ATTAACCCATACATGAGCTCTCCCTGCCACATTGAGATGATCCTT ACGGAAAAGGAACAGATTGTTCCTAAACCAGAAGAGGAGGTTGCC CAGAAGAAAAAGATATCCCAGAAGAAACTGAAGAAACAAAAACTT ATGGCACGGGAG |
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| Protein sequence | MVRYSLDPENPTKSCKSRGSNLRVHFKNTRETAQAIKGMHIRKAT KYLKDVTLQKQCVPFRRYNGGVGRCAQAKQWGWTQGRWPKKSAEF LLHMLKNAESNAELKGLDVDSLVIEHIQVNKAPKMRRRTYRAHGR INPYMSSPCHIEMILTEKEQIVPKPEEEVAQKKKISQKKLKKQKL MARE |
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E.coli 발현클론의 단백질 발현 방법 (vector : pDEST15, 17, 42)
① 분양된 클론은 발현벡터로 형질전환된 BL21+ strain의 대장균이다.
② 10 ul의 분양 받은 클론 배양액 (1/100)을 1ml의 M9ZB 배지 a) (+Amp-100ug/ml)에 접종한 후 37 ℃ 에서 16시간 전배양한다. ③ 10 ul의 전배양액을 1 ml의 M9ZB 배지 a) (+Amp-100ug/ml)에 접종한 후 37℃ 에서 3시간 배양한다. ④ ③의 배양액에 0.5 mM IPTG를 첨가 후 37 ℃ 에서 5시간 배양한다. ⑤ ④의 배양액을 3000 rpm, 4℃, 25 min 동안 원심 분리한 후, 상등액은 전부 제거하고 대장균을 모은다. ⑥ ⑤의 대장균에 100ul의 Lysis buffer b)를 첨가한 후, 37 ℃, 20min 동안 shaking incubation한다. ⑦ 20ul의 ⑥번 시료와 5 ul의 Sample buffer(5X sample buffer)를 혼합한 후, 100℃에서 끓인다. ⑧ 3ul의 ⑦번 시료을 SDS-PAGE에 loading한 후 아래와 같이 전기영동한다.
- Tag-N-GST 융합단백질: 10% SDS-PAGE, 80V/20min 후 100V/80min
⑨ CBB staining 또는 Western blotting 방법에 의해 단백질 발현 유무를 확인한다.- Tag-N-His 또는 C-His 융합단백질 : 12% SDS-PAGE, 80V/20min 후 120V/80min
- CBB staining 일 경우 :
ㆍRunning 끝난 gel 을 3차 D.W로 1회 세척 후 세척액을 완전히 제거한다.
ㆍCBB solution을 넣고 2시간 동안 shaking 하며 staining 한다. (Sun-gel staining solution 이용(LPS solution사, Cat No.: SGS01) ㆍCBB solution을 버린 후 3차 D.W 로 30분씩 3회 이상 세척한다. ㆍ단백질 발현 유무를 확인 한다.
- Western blot 일 경우 :
ㆍRunning 끝난 gel 을 NC membrane에 300mA/90min으로 transfer 한다.
ㆍTransfer된 membrane에 1% skim milk 용액을 넣고 실온에서 30min 동안 blocking 한다. ㆍ1차 Antibody를 희석 (1:2000 )하여 4 ℃, 1시간 동안 반응한다. (anti-GST Ab(Santacruz, sc-138), anti-His Ab(Qiagen, 34660) ㆍ1X TBST로 상온에서 10분씩 3회 washing 한다. ㆍ2nd antibody(anti-Mouse, santacruz)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 20분 동안 반응한다. ㆍ1X TBST로 상온에서 10분씩 3회 washing 한다. ㆍRAS(모델명 : FUJIFILM LAS-4000) 기기를 이용하여 Detection 하여 단백질 발현 유무를 확인한다. A. M9ZB 배지 조성
①~④를 섞어 1L로 만든 후 사용한다 B. Lysis buffer
C. 예시
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Mammalian 발현 클론 확인 (pDEST27, 40, 47E, 53E)
유전자은행에서는 모든 Mammalian cell에서의 발현 확인은 96 well scale 로 진행 하였습니다.
① 분양 받은 클론을 LB media 2ml culture 한 후 plasmid DNA prep kit를 이용하여 분리 하며 농도를 확인 한다. ② 293T cells을 1.7 X 104 cells 수로 96well에 seeding 한다. ③ 37℃ , 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다. ④ 0.3ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, reagent)과 10ul OPTI-MEM을 혼합한 후 상온에서 5분 동안 놓는다. ⑤ ①에서 분리한 plasmid DNA의 총 농도가 300~500ng이 되도록 하고 상온에서 5분 방치한 ④번 혼합액에 넣고 섞어준다. ⑥ 혼합 후 상온에서 20분 동안 방치한다. ⑦ ⑥ 번 이후 반응한 샘플 전체를 293T cell이 있는 96well에 넣는다. ⑧ 37℃ , 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다. ⑨ 24시간 후 배지를 제거하고 cell을 harvest 한다. (GFP 벡터(pDEST47E, 53E)의 경우, 형광현미경으로 먼저 발현을 확인한다)
⑩ Harvest 한 Cell pellet에 20ul RIPA buffer 와 5ul Sample buffer(5X sample buffer)를 혼합하여 lysis 시킨다.⑪ Lysis 된 sample 을 100℃ 물에서 끓인다. ⑫ GFP 벡터(pDEST47E, 53E) 인 경우 형광현미경을 이용하여 형광발현 확인 및 Western blotting 을 이용하여 발현 유무를 확인 (Tagging에 따라 GST 또는 His, GFP antibody 이용)한다.
1) Western blot 일 경우
ㆍ10% SDS-PAGE (Tag-N-GST, N/C-EGFP 일 경우), 12% SDS-PAGE (Tag-N-His, C-His 일 경우) 제조한다.
ㆍ ⑪번 시료 20ul를 loading 한다. ㆍ running V/Time 확인한후 진행 한다. – 80V/20min 후 100V/1hr 20min (Tag-N-GST, N/C-EGFP 일 경우) – 80V/20min 후 120V/1hr 20min (Tag-N/C-His 일 경우) ㆍTransfer된 membrane에 5% skim milk을 넣고, 상온에서 1시간 동안 blocking 한다. ㆍ1차 Antibody 를 희석하여 4도/16hr 동안 반응한다. – anti-GST(Santacruz, sc-138), anti-His(Qiagen, 34660) – anti-GFP (Santacruz, sc-9996) : 1:2000 희석 ㆍ2차 antibody를 1:5000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응한다. ㆍ반응 후 1X TBST로 상온에서 10분씩 3회 washing 한다. ㆍLAS(모델명 : FUJIFILM LAS-4000) 기기를 이용하여 Detection 하여 발현 유무를 확인한다. 예시
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| Gene Location | Chromosome | 18 | |||||||||||
| Location | 18q21 | ||||||||||||
| Strand |
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| Database links | RefSeq | NM_001199341 | |||||||||||
| KEGG Genes | 6139 | ||||||||||||
| GeneCard | RPL17 |
| sequence | sequence of CDS | ATGGTTCGCTATTCACTTGACCCGGAGAACCCCACGAAATCATGCAAATCAAGAGGTTCCAATCTTCGTGTTCACTTTAAGAACACTCGTGAAACTGCTCAGGCCATCAAGGGTATGCATATACGAAAAGCCACGAAGTATCTGAAAGATGTCACTTTACAGAAACAGTGTGTACCATTCCGACGTTACAATGGTGGAGTTGGCAGGTGTGCGCAGGCCAAGCAATGGGGCTGGACACAAGGTCGGTGGCCCAAAAAGAGTGCTGAATTTTTGCTGCACATGCTTAAAAACGCAGAGAGTAATGCTGAACTTAAGGGTTTAGATGTAGATTCTCTGGTCATTGAGCATATCCAAGTGAACAAAGCACCTAAGATGCGCCGCCGGACCTACAGAGCTCATGGTCGGATTAACCCATACATGAGCTCTCCCTGCCACATTGAGATGATCCTTACGGAAAAGGAACAGATTGTTCCTAAACCAGAAGAGGAGGTTGCCCAGAAGAAAAAGATATCCCAGAAGAAACTGAAGAAACAAAAACTTATGGCACGGGAGTAA |
| sequence of protein | MVRYSLDPENPTKSCKSRGSNLRVHFKNTRETAQAIKGMHIRKATKYLKDVTLQKQCVPFRRYNGGVGRCAQAKQWGWTQGRWPKKSAEFLLHMLKNAESNAELKGLDVDSLVIEHIQVNKAPKMRRRTYRAHGRINPYMSSPCHIEMILTEKEQIVPKPEEEVAQKKKISQKKLKKQKLMARE | |
| Database link | RefSeq | NM_001199341 |
| UniProt | ||
| CCDS |
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Gene Ontology Provided by GOA (www.ebi.ac.uk/GOA)
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| Disease | Summary |
| Ribosomes, the organelles that catalyze protein synthesis, consist of a small 40S subunit and a large 60S subunit. Together these subunits are composed of 4 RNA species and approximately 80 structurally distinct proteins. This gene encodes a ribosomal protein that is a component of the 60S subunit. The protein belongs to the L22P family of ribosomal proteins. It is located in the cytoplasm. This gene has been referred to as rpL23 because the encoded protein shares amino acid identity with ribosomal protein L23 from Halobacterium marismortui; however, its official symbol is RPL17. As is typical for genes encoding ribosomal proteins, there are multiple processed pseudogenes of this gene dispersed through the genome. Alternative splicing results in multiple transcript variants. Read-through transcription also exists between this gene and the neighboring downstream C18orf32 (chromosome 18 open reading frame 32) gene. [provided by RefSeq, Dec 2010] |
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