Expression Clone
| Basic Informations | Advanced Informations |
| Kind | E.coli N-GST |
a)
b)
a) CBB staining
b) Western blot
|
| Clone ID | KE0012_eNGST | |
| 예상 사이즈 (kD) | 44.6 | |
| 실제 사이즈 (kD) | 51.6 | |
| Vector | pDEST15 | |
| Tag | N-GST | |
| Price | \110,000 (부가세 포함가) | |
| 형광사진 (클릭하여 크게보기) |
이미지가 없습니다 | |
|
|
||
| Kind | E.coli N-His |
a)
b)
a) CBB staining
b) Western blot
|
| Clone ID | KE0012_eNHis | |
| 예상 사이즈 (kD) | 22.7 | |
| 실제 사이즈 (kD) | 27.8 | |
| Vector | pDEST17 | |
| Tag | N-His | |
| Price | \110,000 (부가세 포함가) | |
| 형광사진 (클릭하여 크게보기) |
이미지가 없습니다 | |
|
|
||
| Kind | Mammalian C-EGFP |
이미지가 없습니다
|
| Clone ID | KE0012_mCEGFP | |
| 예상 사이즈 (kD) | 43.7 | |
| 실제 사이즈 (kD) | X | |
| Vector | pDEST47 | |
| Tag | C-EGFP | |
| Price | \110,000 (부가세 포함가) | |
| 형광사진 (클릭하여 크게보기) |
 "200X_1")  "200X_2")
|
|
|
|
||
| Clone information |
Protein sequence length | 154 |
| DNA sequence | ATGACCACAACCACCACCTTCAAGGGAGTCGACCCCAACAGCAGG AATAGCTCCCGAGTTTTGCGGCCTCCAGGTGGTGGATCCAATTTT TCATTAGGTTTTGATGAACCAACAGAACAACCTGTGAGGAAGAAC AAAATGGCCTCTAATATCTTTGGGACACCTGAAGAAAATCAAGCT TCTTGGGCCAAGTCAGCAGGTGCCAAGTCTAGTGGTGGCAGGGAA GACTTGGAGTCATCTGGACTGCAGAGAAGGAACTCCTCTGAAGCA AGCTCCGGAGACTTCTTAGATCTGAAGGGAGAAGGTGATATTCAT GAAAATGTGGACACAGACTTGCCAGGCAGCCTGGGGCAGAGTGAA GAGAAGCCCGTGCCTGCTGCGCCTGTGCCCAGCCCGGTGGCCCCG GCCCCAGTGCCATCCAGAAGAAATCCCCCTGGCGGCAAGTACAGC CTCGTCTTGGGT |
|
| Protein sequence | MTTTTTFKGVDPNSRNSSRVLRPPGGGSNFSLGFDEPTEQPVRKN KMASNIFGTPEENQASWAKSAGAKSSGGREDLESSGLQRRNSSEA SSGDFLDLKGEGDIHENVDTDLPGSLGQSEEKPVPAAPVPSPVAP APVPSRRNPPGGKYSLVLG |
|
E.coli 발현클론의 단백질 발현 방법 (vector : pDEST15, 17, 42)
① 분양된 클론은 발현벡터로 형질전환된 BL21+ strain의 대장균이다.
② 10 ul의 분양 받은 클론 배양액 (1/100)을 1ml의 M9ZB 배지 a) (+Amp-100ug/ml)에 접종한 후 37 ℃ 에서 16시간 전배양한다. ③ 10 ul의 전배양액을 1 ml의 M9ZB 배지 a) (+Amp-100ug/ml)에 접종한 후 37℃ 에서 3시간 배양한다. ④ ③의 배양액에 0.5 mM IPTG를 첨가 후 37 ℃ 에서 5시간 배양한다. ⑤ ④의 배양액을 3000 rpm, 4℃, 25 min 동안 원심 분리한 후, 상등액은 전부 제거하고 대장균을 모은다. ⑥ ⑤의 대장균에 100ul의 Lysis buffer b)를 첨가한 후, 37 ℃, 20min 동안 shaking incubation한다. ⑦ 20ul의 ⑥번 시료와 5 ul의 Sample buffer(5X sample buffer)를 혼합한 후, 100℃에서 끓인다. ⑧ 3ul의 ⑦번 시료을 SDS-PAGE에 loading한 후 아래와 같이 전기영동한다.
- Tag-N-GST 융합단백질: 10% SDS-PAGE, 80V/20min 후 100V/80min
⑨ CBB staining 또는 Western blotting 방법에 의해 단백질 발현 유무를 확인한다.- Tag-N-His 또는 C-His 융합단백질 : 12% SDS-PAGE, 80V/20min 후 120V/80min
- CBB staining 일 경우 :
ㆍRunning 끝난 gel 을 3차 D.W로 1회 세척 후 세척액을 완전히 제거한다.
ㆍCBB solution을 넣고 2시간 동안 shaking 하며 staining 한다. (Sun-gel staining solution 이용(LPS solution사, Cat No.: SGS01) ㆍCBB solution을 버린 후 3차 D.W 로 30분씩 3회 이상 세척한다. ㆍ단백질 발현 유무를 확인 한다.
- Western blot 일 경우 :
ㆍRunning 끝난 gel 을 NC membrane에 300mA/90min으로 transfer 한다.
ㆍTransfer된 membrane에 1% skim milk 용액을 넣고 실온에서 30min 동안 blocking 한다. ㆍ1차 Antibody를 희석 (1:2000 )하여 4 ℃, 1시간 동안 반응한다. (anti-GST Ab(Santacruz, sc-138), anti-His Ab(Qiagen, 34660) ㆍ1X TBST로 상온에서 10분씩 3회 washing 한다. ㆍ2nd antibody(anti-Mouse, santacruz)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 20분 동안 반응한다. ㆍ1X TBST로 상온에서 10분씩 3회 washing 한다. ㆍRAS(모델명 : FUJIFILM LAS-4000) 기기를 이용하여 Detection 하여 단백질 발현 유무를 확인한다. A. M9ZB 배지 조성
①~④를 섞어 1L로 만든 후 사용한다 B. Lysis buffer
C. 예시
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Mammalian 발현 클론 확인 (pDEST27, 40, 47E, 53E)
유전자은행에서는 모든 Mammalian cell에서의 발현 확인은 96 well scale 로 진행 하였습니다.
① 분양 받은 클론을 LB media 2ml culture 한 후 plasmid DNA prep kit를 이용하여 분리 하며 농도를 확인 한다. ② 293T cells을 1.7 X 104 cells 수로 96well에 seeding 한다. ③ 37℃ , 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다. ④ 0.3ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, reagent)과 10ul OPTI-MEM을 혼합한 후 상온에서 5분 동안 놓는다. ⑤ ①에서 분리한 plasmid DNA의 총 농도가 300~500ng이 되도록 하고 상온에서 5분 방치한 ④번 혼합액에 넣고 섞어준다. ⑥ 혼합 후 상온에서 20분 동안 방치한다. ⑦ ⑥ 번 이후 반응한 샘플 전체를 293T cell이 있는 96well에 넣는다. ⑧ 37℃ , 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다. ⑨ 24시간 후 배지를 제거하고 cell을 harvest 한다. (GFP 벡터(pDEST47E, 53E)의 경우, 형광현미경으로 먼저 발현을 확인한다)
⑩ Harvest 한 Cell pellet에 20ul RIPA buffer 와 5ul Sample buffer(5X sample buffer)를 혼합하여 lysis 시킨다.⑪ Lysis 된 sample 을 100℃ 물에서 끓인다. ⑫ GFP 벡터(pDEST47E, 53E) 인 경우 형광현미경을 이용하여 형광발현 확인 및 Western blotting 을 이용하여 발현 유무를 확인 (Tagging에 따라 GST 또는 His, GFP antibody 이용)한다.
1) Western blot 일 경우
ㆍ10% SDS-PAGE (Tag-N-GST, N/C-EGFP 일 경우), 12% SDS-PAGE (Tag-N-His, C-His 일 경우) 제조한다.
ㆍ ⑪번 시료 20ul를 loading 한다. ㆍ running V/Time 확인한후 진행 한다. – 80V/20min 후 100V/1hr 20min (Tag-N-GST, N/C-EGFP 일 경우) – 80V/20min 후 120V/1hr 20min (Tag-N/C-His 일 경우) ㆍTransfer된 membrane에 5% skim milk을 넣고, 상온에서 1시간 동안 blocking 한다. ㆍ1차 Antibody 를 희석하여 4도/16hr 동안 반응한다. – anti-GST(Santacruz, sc-138), anti-His(Qiagen, 34660) – anti-GFP (Santacruz, sc-9996) : 1:2000 희석 ㆍ2차 antibody를 1:5000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응한다. ㆍ반응 후 1X TBST로 상온에서 10분씩 3회 washing 한다. ㆍLAS(모델명 : FUJIFILM LAS-4000) 기기를 이용하여 Detection 하여 발현 유무를 확인한다. 예시
|
|||||||||
| Gene Location | Chromosome | 17 | |||||||||||
| Location | 17q25.1 | ||||||||||||
| Strand |
|
||||||||||||
| Database links | RefSeq | NM_016185 | |||||||||||
| KEGG Genes | 51155 | ||||||||||||
| GeneCard | HN1 |
| sequence | sequence of CDS | ATGACCACAACCACCACCTTCAAGGGAGTCGACCCCAACAGCAGGAATAGCTCCCGAGTTTTGCGGCCTCCAGGTGGTGGATCCAATTTTTCATTAGGTTTTGATGAACCAACAGAACAACCTGTGAGGAAGAACAAAATGGCCTCTAATATCTTTGGGACACCTGAAGAAAATCAAGCTTCTTGGGCCAAGTCAGCAGGTGCCAAGTCTAGTGGTGGCAGGGAAGACTTGGAGTCATCTGGACTGCAGAGAAGGAACTCCTCTGAAGCAAGCTCCGGAGACTTCTTAGATCTGAAGGGAGAAGGTGATATTCATGAAAATGTGGACACAGACTTGCCAGGCAGCCTGGGGCAGAGTGAAGAGAAGCCCGTGCCTGCTGCGCCTGTGCCCAGCCCGGTGGCCCCGGCCCCAGTGCCATCCAGAAGAAATCCCCCTGGCGGCAAGTCCAGCCTCGTCTTGGGTTAG |
| sequence of protein | MTTTTTFKGVDPNSRNSSRVLRPPGGGSNFSLGFDEPTEQPVRKNKMASNIFGTPEENQASWAKSAGAKSSGGREDLESSGLQRRNSSEASSGDFLDLKGEGDIHENVDTDLPGSLGQSEEKPVPAAPVPSPVAPAPVPSRRNPPGGKSSLVLG | |
| Database link | RefSeq | NM_016185 |
| UniProt | ||
| CCDS |
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Gene Ontology Provided by GOA (www.ebi.ac.uk/GOA)
|
| Disease | Summary |
|
||||||||||||||||
