유전자은행에서는 모든 Mammalian cell에서의 발현 확인은 96 well scale 로 진행 하였습니다.

① 분양 받은 클론을 LB media 2ml culture 한 후 plasmid DNA prep kit를 이용하여 분리 하며 농도를 확인 한다.
② 293T cells을 1.7 X 104 cells 수로 96well에 seeding 한다.
③ 37℃ , 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다.
④ 0.3ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, reagent)과 10ul OPTI-MEM을 혼합한 후 상온에서 5분 동안 놓는다.
⑤ ①에서 분리한 plasmid DNA의 총 농도가 300~500ng이 되도록 하고 상온에서 5분 방치한 ④번 혼합액에 넣고 섞어준다.
⑥ 혼합 후 상온에서 20분 동안 방치한다.
⑦ ⑥ 번 이후 반응한 샘플 전체를 293T cell이 있는 96well에 넣는다.
⑧ 37℃ , 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다.
⑨ 24시간 후 배지를 제거하고 cell을 harvest 한다.
⑩ Harvest 한 Cell pellet에 20ul RIPA buffer 와 5ul Sample buffer(5X sample buffer)를 혼합하여 lysis 시킨다.
⑪ Lysis 된 sample 을 100℃ 물에서 끓인다.
⑫ GFP 벡터(pDEST47E, 53E) 인 경우 형광현미경을 이용하여 형광발현 확인 및 Western blotting 을 이용하여 발현 유무를 확인 (Tagging에 따라 GST 또는 His, GFP antibody 이용)한다.