cDNA
01. mRNA Sources
- Stomach: cancer cell lines, Normal tissues, Primary cancer tissues
- Liver: cancer cell lines, Normal tissues, Primary cancer tissues
- Brain: Normal tissues, Primary cancer tissues
- Cervix: Cancer cell lines
- Thymus: Normal tissues
- 각 library별로 사용된 mRNA source, vector, library type 등 보다 자세한 사항은 [Library Bank] 참조
02. Library Types
- Library Bank for distribution
- [F] Full-length enriched cDNA library
- [U] Universal cDNA library
- [Fs] Subtracted full-length enriched cDNA library
- [Un] Normalized universal cDNA library
- [Us] Subtracted universal cDNA library
03. Vectors
- pTZ18RP1
- pT7T3-Pac
- pCNS-D2: mammalian expression vector (CMV promoter)
- pCNS (AF416744): mammalian expression vector (CMV promoter)
- pME18S-FL3 (AB009864): mammalian expression vector (SV40 promoter)(*Kindly gifted by Dr. Sugano)
- Other
04. Library Construction Methods
05. Sequencing
- Sequenced direction: 5'-end
- Sequencing machines: ABI 3700, MegaBACE 1000, MegaBACE 4000
- Sequencing primers
06. EST Analyses
- Basecalling: phred
- Vector-trimming: fasta
- Repeat-masking: RepeatMasker
- Annotation: BLASTN against human mRNA, human UniGene; BLASTX against NR proteins
- Clustering: cap3
- sequencing error나 overlap이 없는 경우 등, 다양한 이유로 인하여 동일 gene이 두개 이상의 cluster로 묶이거나, 비슷한 paralogous gene들이 하나의 cluster로 묶일 수 있음.
07. Clustering & Re-Arraying
- Non-redundant clone의 유지 및 분양을 위하여 대표 clone을 모아 재배열함.
- Contig generation: cap3
- Annotation: BLASTN against human mRNA, human UniGene; BLASTX against NR proteins
- Clone에 대한 정보는 annotation을 한 방법 및 시점에 따라 다소 차이가 있거나, 새로운 정보가 반영되지 못할 수도 있음.
01. 각 클론에 대한 기본 정보 수집
1) CLONE ID :
- KU :Korean UniGene Clone, supported by The Center for Functional Analysis of Human Genome, 21C frontier
- BKU :Brain Korean UniGene Clone, supported by The Korea Human Gene Bank
- hMU : Human MGC (Mammalian Gene Collection) Clone, supported by NCI
- hIU : Re-Sequenced Human InCyte (UniGEM V2) Clone , supported by The Center for Functional Analysis of Human Genome, 21C frontier
- BU : Mouse BMAP Clone, supported by Brain Molecule Anatomy Project
- NU : Mouse NIA Clone, supported by National Institute of Aging
- mNU : Mouse MGC Clone, supported by Mammalian Gene Collection, NCI
2) CLONE PLATE
- CLONE containing library information
- mRNA Source / Vector / Methods of libraries
- 5' End and Contig Seqeunce
02. Public database 에서의 homology 검색
1) 사용한 data source :
- Human Refseq (from Mar 03 2020)/Unigene (from Apr 25 2013)
- Mouse Refseq ( from Dec 06 2016)
2) 클론 annotation :
- Known gene : RefSeq mRNA 또는 human mRNA에 대해 90% 이상의 identity를 가질 경우
- Known EST : RefSeq mRNA 또는 human mRNA에 대해 90% 이하의 identity를 가지고 UniGene ESTs에 대해 90% 이상의 identity를 가질 경우
- Novel gene : 위의 Known gene, Known EST에 해당되지 않는 경우 Novel gene으로 정의함
3) 각 gene에 대한 정보 추출 :
- Symbol, Alias, and Title of Gene, chromosome, GO (Gene Ontology) , and OMIM
03. Fullness의 명명
1) RefSeq mRNA 또는 Human mRNA에서 FASTA 프로그램 수행
- F (Full-length clone) : 유전자의 CDS 염기서열의 개시코돈과 종결코돈을 완전히 포함하며 90% 이상의 identity를 가지는 경우, (Sequence verified)
-
FC (Full-length Candidate) :
a. 유전자의 CDS 개시코돈으로 부터 연속적으로 50bp 이상의 염기서열을 포함하며 90% 이상의 identity를 가지는 경우, (5’ end sequenced)
b. 5'UTR 영역부터 100bp 이상 염기서열을 포함하며 90% 이상의 identity를 가지는 경우, (5’ end sequenced) - P (partial clone) : 유전자의 CDS 개시코돈을 포함하지 않고 부분적인 염기서열을 포함하며 90% 이상의 identity를 가지는 경우
- Unknown : 유전자의 CDS 정보가 명시되어 있지 않는 경우
- - : RefSeq mRNA or Humn mRNA에 대해 identity가 90% 이하일 경우
04. Public database 에서의 다양한 정보 추출
- 1) Genome Mapping 정보: UCSC Genome Browser (with over 90% identities)
- 2) Signal Transduction Pathway 정보 : BioCarta
- 3) 질병과 유전자 발현 패턴 관련 정보 :WIGED (by NGIC), GeneCards (by weizmann), SOURCE (by stanford)
- 4) 단백질과 Genome Annotation 관련 정보 : ExPASY, ENSEMBL
- 5) Motif 와 Initiation codon 관련 정보 : BLOCKS, ATPpr, BLASTX, ...
